دانشگاه علوم پزشکی قزوین
دانشکده پزشکی
پایان نامه کارشناسی ارشد
گروه زیست فناوری پزشکی
موضوع :
ارزیابی اثرات برخی پپتید های اتصال یابنده به رسپتور Trk Bبر روی رده های سلولی Sk-ov-3 و Ov-car-3
اساتید راهنما:
آقای دکتر نعمت الله غیبی
آقای دکتر مرتضی کریمی پور
اساتید مشاور:
آقای دکتر حمزه رحیمی
آقای مهندس جوادی
تابستان 1392
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
عنوان صفحات
سرطان. 6
درمان سرطان. 8
گیرنده TrkB وعملکردآن. 9
Trk B وسرطان. 11
ساختار Trk B.. 12
سایتهای اتصال یابنده در رسپتور Trk. 13
فاکتورهای نئوروترفیک وعملکرد آنها 13
پروتئین BDNFوعملکردآن. 15
داروهای مهارکننده Trk B.. 17
پپتید درمانی.. 17
بیوانفورماتیک… 28
فلوسایتومتری.. 29
Western Blot 30
مواد و روشها 32
طراحی کتابخانه پپتیدی.. 33
ایجاد اسکلتهای انعطاف پذیر پپتیدی.. 34
طبقه بندی پپتیدهای تولیدشده براساس انرژی.. 35
انتخاب بهترین پپتیدها براساس انرژی.. 36
ایجاد ساختار سه بعدی پایدارترین پپتیدها 36
اتصال پپتیدهای طراحی شده باگیرندهTrk B.. 36
بررسی اندرکنشهای پپپتیدی و رسپتور. 38
بخش ازمایشگاهی.. 38
محلولها 38
کشت سلولی.. 38
پاساژسلولی (sub-culture) 39
سلولهای چسبنده. 39
سلولهای سوسپانت.. 40
فریز کردن. 40
طرزتهیهFBS دکمپلمان برای استفاده درکشت سلولی.. 41
ذوب کردن. 41
شمارش سلولی.. 41
MTT Assay. 42
غلظتهای استفاده شده برای پپتید. 43
فلوسایتومتری.. 43
استخراج پروتئین.. 44
مواد مورد استفاده برای جمع آوری کردن(Harvest) سلول. 45
اندازه گیری پروتئین با روش برادفورد. 47
مراحل وسترن بلاتینگ… 47
آماده سازی ژلSDS-PAGE 48
آماده کردن پروتئینها برای Loading در SDS-PAGE.. 50
مرحله ترانسفر. 51
Preparation of solutions. 52
آماده کردن کاغذ pvdf. 53
مرحله بلات کردن. 53
طراحی کتابخانه پپتیدی.. 55
IC50% سلولها 57
پیشگویی ساختار سه بعدی.. 58
تداخل لیگاند – رسپتور. 59
آمینواسیدهای شرکت کننده دراندرکنش… 61
نمایش اندرکنشهای گیرنده Trk Bبا پپتیدهای طراحی شده. 62
بررسی اثر توکسیک پپتیدهای سنتزشده با آزمون بقا سلول. 65
نتایج فلوسایتومتری.. 71
نتایج وسترن بلات.. 77
اندرکنشهای پپتیدها و رسپتور. 79
بحث.. 82
منابع. 90
خلاصه فارسی
سرطان به عنوان دومین عامل مرگ ومیر بعد از بیماریهای قلبی ساخته شده است،یکی از مهمترین پروتئینهای انکوژن TREKB می باشد که لیگاند اختصاصی آن BDNF(Brain derived neutrophic factor) می باشد وبیان بیش از حد این گیرنده در سرطانهای پروستات و مولتیپل مایلوما و تخمدان و تیروئید مشاهده شده است.
BDNF با اتصال خود به گیرنده TRK B باعث دایمراسیون در این گیرنده و ایجاد سیگنالهایی در مسیرآنژیوژنسیس و افزایش میزان تعداد سلولها می شود ،هدف این مطالعه طراحی پپتیدهایی بر علیه گیرنده TRK B (Tropomyosin Receptor B Kinase) به عنوان مهار کننده می باشد،در این مطالعه ابتدا در قسمت Insilico کتابخانه پپتیدی با روش sequence tolerance و backrub ساخته شد و بهینه سازی انرژی پپتید با با بهره گرفتن از روش مونتو کارلوانجام شد و پپتیدهایی با حداکثر پایداری بر اساس انرژی توسط نرم افزارRانتخاب شدند و سپس ساختار سه بعدی پپتیدها با بهره گرفتن از روش دینامیک مولکولی با بهره گرفتن از نرم افزار7 Hyperchem تعیین گردیدو Docking این پپتید ها توسط نرم افزار HADDOCK تکمیل گردید،نحوه اتصال آنها توسط نرم افزار Lighplot انالیز شد و ساختار سه بعدی این پپتید ها با گیرنده توسط نرم افزار PYMOL نمایش داده شد و در نهایت توالی 2 عدد از بهترین پپتیدها با کمترین انرژی توسط شرکت Tag copeghene دانمارک سنتز شدند .
در قسمت آزمایشگاهی، ابتدا با انجام تست MTT اثر توکسیک پپتید یک و دو در غلظتهای 50 ،200 ،350، 500 نانو مولار و سیکلو تراکسین در غلظت 200 نانو مولار به عنوان کنترل مثبت بر روی رده سلولی ,RPMI822, Sk-ov-3,Ov-car-3U266 مطالعه شد و سپس فلوسایتومتری برای سلولها با کیت ّّّFITC-Annexin V در غلظتهای 450 و 350 نانو مولار برای پپتید یک و دو و در غلظت 200 نانو مولار برای سیکلو تراکسین انجام گردید، سپس پروتینها بعد از تیمار با بهره گرفتن از لیز بافر ، لیز شده و پروتئین های آنها استخراج گردید و غلظت پروتئین توسط دستگاه اسپکترومتری برادفورد مشخص شد و سپس Western blotting برای بررسی میزان بیان پروتئینها بعداز تیمار انجام شد.
یافته هانشان داد که پپتیدهای طراحی شده دارای تمایل اتصال بالایی به رسپتور TrkBمی باشند و باعث مهار رشد سلولی در رده سلولی مذکور شده اند و نتایج این مطالعه نشان داد که مهار رسپتور Trk B می تواند به توقف رشد سلول سرطانی منجر شود.
Abstract
Cancer is the second cause of death after heart diseases in the worlwild.One of the important oncogen proteins is tropomyosin related kinase (TRK) which it’s ligand is brain derived neutrophic factor (BDNF).Over-expression of Trk B was observed in thyroeid, ovarian cancer, prostat cancer and multiple myloma.
BDNF bindingto TrkB lead toTrk B dimerization and activation of angiogenesis and increasing proliferationsignalings.
The objective of this study is design new peptides againstto Trk B receptor as an inhibitor. Firstly, in sillico section, a peptide library was generated by using tolerance sequence and backrub protocols. Then, peptides were energy minimazed by means Monte Carlo methods. Finally, the highest stabe peptides were choosen based on the lowest energy score in an R package. Three dimensional structures of the peptides were predicted by hyperchem 7 software.Binding pattern of designed peptides with receptore was investigated using HADDOCK web server.
The two-dimentional and 3D view of the interaction of peptides with trk b receptor was visualized by meansLighPlot+ and PyMol softwares. Finally two peptide sequences were synthesized by Cophgen Company in Denmark.
In the experimental section, cell linens (skov-3, ov-car-3, U266, PRMI-8226) were treated four concentrations of peptides: 50, 200, 350, 500 nanomolar (nM).The cytotoxic effects of the peptides wereevaluated using MTT assay.
The annexin V-FITC and P1 stianing and FACS analysis were used for investigation the apoptosis in treated cells. The cell signaling pathways were studied via evaluation of expression ofAKT,EIF4E,MAPK using immune-blotting.In this work, Cyclotraxin (200nM) used as a positive control in all of experments.
سرطان
سرطان سلولها به طور غیر عادی تقسیم و تکثیر شده و بافت‌های سالم را از بین برده می شود. سلولهای سرطانی از حالت عادی تقسیم و رشد سلولها جدا می شود. سرطان به عنوان دومین عامل مرگ ومیر در جهان بعد ازسکته قلبی شناخته شده است و در واقع سرطان به علت مرگ بالای آن به عنوان یک عامل کشنده محسوب می شود و طبق آمار جهانی در سال 2011 در حدود 1596670 نفر مبتلا و در حدود 571950 نفر در اثر این بیماری جان خود را از دست داده اند(1). آمار نشان داده است مرگ در اثر سر طان 1 نفر از هر 4 آمریکایی می باشد و در ایران سر طان به عنوان سومین عامل مرگ ومیر می باشد(2). بیشترین سرطانهای شایع شامل سرطان های ریه، معده ، کولورکتال، کبد و سرطان pestan می باشد(3, 4). سرطان دارای دو جنبه محیطی( در حدود 90% ) و ژنتیکی ( در حدود 10%) می باشد که از علتهای محیطی می توان به سیگار، رژیم های غذایی و چاقی، پرتوافکنی، عفونت، استرس، فقدان فعالیت فیزیکی وآلودگی محیطی اشاره نمود(5). تنباکو دارای چندین عامل کارسینوژن شامل نیتروزامین و هیدروکربن های آروماتیک است که ارتباط مستقیم با سرطان ریه و حنجره دارند و رژیم غذایی و کمبود فعالیت فیزیکی علت 30% از سرطان ها می باشد(6, 7). پرتوافکنی یونیزه و غیر یونیزه با سرطان در ارتباط می باشند. شکست DNA بوسیله پرتو افکنی منجر به فعالیت ژنی، خاموش شدن و حذف شدگی در کروموزوم می شود. وراثت در بسیاری از سرطانها نقش مهمی ندارد ولی بعضی از جهش ها در ژن BRCA1 منجر به سرطان pestan و تخمدان می شود که به عدم تعادل تولید سلولها و مرگ سلولی منجر می شود که دو جنبه مهم در چرخه سلولی می باشند(8, 9). عوامل ژنتیکی به 2 گروه طبقه بندی می شوند، انکوژن ها که منجر به رشد سلولی می شود و گروه دیگر که نقش مهمی در مهار رشد و تقسیم سلولی دارند به نام تومور ساپرسور هاشناخته شده اند(10, 11). از مهمترین انکوژن ها می توان RAS ,WNT ,MYC ,ERK و TRK را نام برد(12) و از تومور ساپرسورها می توان به p21, p27 p53, p16, p15, p19 وp18 که در سرطانهای مختلف یافت شده اند اشاره کرد(13, 14). البته لازم به ذکر است که تغییرات ژنتیکی برای ایجاد بعضی از سرطان ها لازم می باشد که این جهش ها به میزان متفاوتی در سرطان های مختلف رخ می دهند. اخیرا نشان داده شده است که تعدادی از پروتو انکوژن ها و تومور ساپرسور ها در سلول به وسیله سیستم تخریبی ubiquitin-proteasome کنترل می شوند(15, 16)، از عوامل دیگری که درایجاد سرطان نقش دارند می توان به تغییرات اپی ژنتیک شامل هایپومتیلاسیون و هایپرمتیلاسیون در سطح DNA اشاره کرد(17, 18)، هایپر متیلاسیون منطقه پروموتور ژن های ساپرسور منجر به کاهش ترجمه این ژنها می شود که به سلول اجازه می دهد بصورت افسار گریخته رشد کند. ژن های جهش یافته در رشد و مرگ سلولی، اندرکنش های سلول –سلول و مسیر های سیگنالینگ سلولی نقش دارند، بی نظمی در چرخه سلولی به عنوان یک عامل خیلی مهم در پاتولوژی سرطان مطرح می باشد(19, 20)، بطوری که جهش درژن هایی از قبیل p53 در 50% از موارد سرطانها دیده شده است(21, 22) در سرطان تغییرات ژنومی، باعث ایجاد موتاسیون هایی می شود که در نهایت منجر به تولید ژن های انکوژن با عملکرد غالب واز دست رفتن عملکرد ژن های ساپرس کننده تومور می شود، که باعث رشد سلولی بیش از حد و غیر نرمال می شود. تومورها به دو گروه طبقه بندی می شوند که شامل تومورهای خوش خیم و بدخیم می باشند(23) سرطان دارای انواع مختلفی می باشد: کارسینوما که از سلو لهای اپی تلیال منشا می گیرند که بیشترین موارد سرطان را شامل می شوند(24, 25)، سارکوما که از بافت های پیوندی مانند استخوان و غضروف و غیره منشاء می گیرند که در حقیقت از سلو لهای مزانشیمی منشا گرفته اندو لوکمیا که از دو نوع از سلولهای هماتوپوئتیک و سلو لهای لنفوما منشا می گیرد و در کودکان حدود 30 % از تومور ها را شامل می شوند، تو مور های سلول زایا در سلو لهای بیضه ، تخمدان و بلاستوما (که از سلو لهای جفتی منشا می گیرد) دیده می شوند(26, 27).
فرم در حال بارگذاری ...