وبلاگ

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست شناسی

 

گرایش :میکروبیولوژی

 

عنوان : طراحی و استقرار روش جدید سم زدایی سریع از  واكسن سیاه سرفه

 

 

 

دانشگاه آزاد اسلامی

 

واحد علوم دارویی

 

دانشکده علوم و فناوریهای نوین، گروه زیست شناسی

 

 

 

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد ((M.Sc))

 

گرایش: میکروبیولوژی

 

 

 

عنوان:

 

طراحی و استقرار روش جدید سم زدایی سریع از  واكسن سیاه سرفه

 

 

 

استاد راهنما:

 

جناب آقای دکتر عبدالرضا موحدی

 

 

 

اساتید مشاور:

 

جناب آقای دکتر اسماعیل اصلی

 

جناب آقای دكتر حسین عطار

 

 

 

سال تحصیلی 92-1391

 

 

 

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

 

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

 

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

 

فهرست مطالب

 

عنوان                                                                                                                              صفحه

 

خلاصه فارسی ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 1

 

فصل اول: کلیات

 

1-1. بیان مسئله ………………………………………………………………………………………………………………………………………… 3

 

1-2. تاریخچه بیماری سیاه سرفه …………………………………………………………………………………………………………….. 4

 

1-3. باکتریولوژی…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 7

 

1-4. ترکیبات مهم باکتری سیاه سرفه …………………………………………………………………………………………………. 10

 

1-4-1. توکسین پرتوسیس…………………………………………………………………………………………………………………….. 10

 

1-4-2. فیلامنتوس هموگلوتینین (FHA)………………………………………………………………………………………….. 12

 

1-4-3. فیمبریه و آگلوتینین ها…………………………………………………………………………………………………………….. 13

 

1-4-4. پرتکتین………………………………………………………………………………………………………………………………………. 15

 

1-4-5. آدنیلات سیکلاز (ACT)…………………………………………………………………………………………………………. 16

 

1-4-6. تراکئال سایتو توکسین (TCT)………………………………………………………………………………………………. 17

 

1-4-7. توکسین حساس به حرارت……………………………………………………………………………………………………….. 18

 

1-4-8. BrKA………………………………………………………………………………………………………………………………………. 18

 

1-4-9. اندوتوکسین………………………………………………………………………………………………………………………………… 19

 

1-5. سویه های بوردتلا پرتوسیس ………………………………………………………………………………………………………… 19

 

1-6. اپیدمیولوژی ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 20

 

1-6-1. وضعیت بیماری در ایران……………………………………………………………………………………………………………. 21

 

1-7. بیماری زایی سیاه سرفه  ………………………………………………………………………………………………………………. 21

 

1-8. علائم کلینیکی ………………………………………………………………………………………………………………………………. 22

 

1-9. تشخیص بیماری …………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

 

1-9-1. تشخیص بالینی………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

 

1-9-2. علائم کلینیکی در نوزادان…………………………………………………………………………………………………………. 24

 

1-9-3. کودکان، نوجوانان و بزرگسالان………………………………………………………………………………………………….. 25

 

1-10. پاسخ ایمنی در برابر سیاه سرفه ………………………………………………………………………………………………… 26

 

1-10-1. پاسخ ایمنی همورال………………………………………………………………………………………………………………… 27

 

1-10-2. پاسخ ایمنی سلولی…………………………………………………………………………………………………………………. 28

 

1-11. روش های آزمایشگاهی تشخیص………………………………………………………………………………………………… 30

 

1-11-1. کشت………………………………………………………………………………………………………………………………………… 30

 

1-11-2. سرولوژی………………………………………………………………………………………………………………………………….. 30

 

1-11-3. PCR …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 32

 

1-12. مدیریت بیماری…………………………………………………………………………………………………………………………….. 33

 

1-13. پیشگیری …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 34

 

1-13-1. راهبردهای بالقوه در مهار بیماری سیاه سرفه در اوایل نوزادی……………………………………………. 35

 

1-13-1-1. واکسیناسیون بالغین و سالمندان……………………………………………………………………………………… 37

 

1-13-1-2. حفاظت غیرمستقیم نوزادان از طریق واکسیناسیون والدین………………………………………….. 37

 

1-13-1-3. ایمن سازی نوزادان و کودکان…………………………………………………………………………………………… 38

 

1-13-1-4. واکسیناسیون مادر در دوران بارداری……………………………………………………………………………….. 38

 

1-14. استراتژی های واکسن………………………………………………………………………………………………………………….. 39

 

1-14-1. واکسن غیر سلولی سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………. 39

 

1-14-2. واکسن سلولی سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………………. 40

 

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

 

2-1. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه…………………………………………………………………………………………………. 42

 

2-1-1. تعریف تست كنترل سمیت زدایی (MWGT) ……………………………………………………………………. 43

 

2-1-2. تعریف تست حفاظتی داخل مغزی موش (تست توانمندی Potency test) …………………… 44

 

2-1-3. ابداع روش کشت……………………………………………………………………………………………………………………….. 44

 

2-1-4. جداسازی سلول باکتری از کشت……………………………………………………………………………………………… 45

 

2-2. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه در انستیتو رازی…………………………………………………………………….. 46

 

2-3. غیرفعال سازی سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه…………………………………………………………….. 47

 

2-3-1. استفاده از فرمالین و تیومرسال برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه…………. 47

 

2-3-2. استفاده از گلوتار آلدهید برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه……………………. 49

 

2-3-3. استفاده از حرارت برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه……………………………….. 49

 

فصل سوم: مواد و روش ها

 

3-1. تجهیزات و وسایل ………………………………………………………………………………………………………………………….. 51

 

3-2. مواد و محیط ها ……………………………………………………………………………………………………………………………… 52

 

3-2-1. محیط کشت آگار بورده ژانگو……………………………………………………………………………………………………. 52

 

3-2-2. محیط کشت وِروِی…………………………………………………………………………………………………………………….. 53

 

3-2-3. محیط B2…………………………………………………………………………………………………………………………………… 54

 

3-2-4. محیط کشت سویابین کازئین…………………………………………………………………………………………………… 54

 

3-2-5. محیط تیوگلیکولات براث………………………………………………………………………………………………………….. 55

 

3-3. روش کار …………………………………………………………………………………………………………………………………………. 56

 

3-3-1. انتخاب سویه های بوردتلا پرتوسیس……………………………………………………………………………………….. 56

 

3-3-1-1. لیوفیلیزه کردن……………………………………………………………………………………………………………………… 56

 

3-3-2. کشت باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………………….. 56

 

3-3-2-1. کشت تجدید حیات روی محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………. 56

 

3-3-2-2. کشت بذر روی محیط وِروِی………………………………………………………………………………………………… 57

 

3-3-2-3. مراحل انجام کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه…………………………………………………………….. 57

 

3-3-2-3-1. استریلیزاسیون فرمانتور…………………………………………………………………………………………………… 57

 

3-3-2-3-2. آماده سازی و بهینه سازی محیط کشت فرمانتوری……………………………………………………… 58

 

3-3-2-3-3. تلقیح بذر به محیط کشت در فرمانتور…………………………………………………………………………… 58

 

3-3-3. جداسازی باکتری سیاه سرفه از محیط کشت…………………………………………………………………………. 59

 

3-3-3-1. جداسازی سلول باکتری با بهره گرفتن از سانتریفوژ…………………………………………………………………. 59

 

3-3-3-2. جداسازی سلول باکتری با بهره گرفتن از سیستم میکرو فیلتراسیون……………………………………. 59

 

3-3-4. غیرفعال سازی سلول باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………………… 60

 

3-3-5. سمیت زدایی سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………. 60

 

3-3-5-1. سمیت زدایی با بهره گرفتن از فرمالین……………………………………………………………………………………… 61

 

3-3-5-2. سمیت زدایی با بهره گرفتن از تیومرسال………………………………………………………………………………….. 61

 

3-3-6. تست های کنترلی سوسپانسیون سیاه سرفه…………………………………………………………………………… 61

 

3-3-6-1. تست استریلیتی……………………………………………………………………………………………………………………. 61

 

3-3-6-2. تست کنترل غیرفعال بودن باكتری…………………………………………………………………………………….. 62

 

3-3-6-3. تست کنترل سمیت زدایی (MWGT) …………………………………………………………………………… 62

 

3-3-6-4. تست توانمندی……………………………………………………………………………………………………………………… 62

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1. تجدید حیات بذر بر روی محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………………… 64

 

4-2. تهیه بذر در محیط وِروِی……………………………………………………………………………………………………………….. 64

 

4-3. کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن……………………………………………………………… 64

 

4-4. جداسازی باکتری سیاه سرفه از کشت………………………………………………………………………………………….. 67

 

4-5. غیرفعال سازی و سمیت زدایی باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن……………………………………… 69

 

4-5-1. سمیت زدایی با فرمالین…………………………………………………………………………………………………………….. 69

 

4-5-2. سمیت زدایی با تیومرسال…………………………………………………………………………………………………………. 69

 

4-6. آزمایش های کنترلی سوسپانسیون های سیاه سرفه……………………………………………………………………. 69

 

4-7. نتایج حاصل از آزمون MWG در کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه

 

سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال…………………………………………………………………………………………….. 72

 

4-8. آزمون MWG و مقایسه تغییرات اوزان موش ها……………………………………………………………………….. 75

 

4-9. تست توانمندی واکسن های آزمایشی سیاه سرفه……………………………………………………………………….. 80

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

 

بحث ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 83

 

نتیجه گیری و پیشنهادات ………………………………………………………………………………………………………………………. 88

 

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 89

 

خلاصه انگلیسی ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 97

 

ضمایم ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 98

 

 فهرست جداول

 

عنوان                                                                                                                             صفحه

 

جدول1-1. آنتی ژن های مختلف سیاه سرفه…………………………………………………………………………………………… 9

 

جدول1-2. علائم کلینیکی بیماری سیاه سرفه……………………………………………………………………………………… 26

 

جدول1-3. آنتی بیوتیک های مورد استفاده در درمان سیاه سرفه حاد و رژیم مصرف آن……………….. 34

 

جدول1-4. واکسیناسیون سیاه سرفه در کشورهای مختلف…………………………………………………………………. 36

 

جدول2-1. ترکیب محیط لیستر و B2  بر اساس گرم در لیتر…………………………………………………………….. 45

 

جدول3-1. لیست دستگاه ها و تجهیزات مورد استفاده………………………………………………………………………… 51

 

جدول3-2. لیست مواد و محیط های مورد استفاده در تولید واکسن سیاه سرفه………………………………. 52

 

جدول3-3. ترکیبات محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………………………………….. 53

 

جدول3-4. ترکیبات محیط کشت وِروِی………………………………………………………………………………………………… 53

 

جدول3-5. ترکیبات محیط کشت B2…………………………………………………………………………………………………… 54

 

جدول3-6. ترکیبات محیط کشت سویابین کازئین………………………………………………………………………………. 55

 

جدول4-1. اطلاعات دوره كشت باكتری سیاه سرفه برای تولید واكسن…………………………………………….. 68

 

جدول4-2. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باكتری  سیاه سرفه سمیت  زدایی شده با فرمالین……………………………………………………………………………………………………………………………….. 70

 

 

جدول4-3. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باكتری  سیاه سرفه سمیت  زدایی شده با تیومرسال…………………………………………………………………………………………………………………………….. 71

 

جدول4-4. نتایج حاصل از کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال با بهره گرفتن از آزمون MWG………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 73

 

جدول4-5. نتایج كنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین با بهره گرفتن از آزمون MWG   76

 

جدول4-6. نتایج كنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با تیومرسال با بهره گرفتن از آزمون MWG 77

 

جدول4-7. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV)     80

 

جدول4-8. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال (TDV)  81

 

 فهرست نمودارها

 

عنوان                                                                                                                صفحه

 

 

 

نمودار1-1. مقایسه تعداد افراد زیر یک سال ایمن شده با واکسن DTP در سه کشور مختلف در سال

 

2000 تا 2010 ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 6

 

نمودار4-1. تغییرات pH کشت سویه 134 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور….. 65

 

نمودار4-2. تغییرات pH کشت سویه 509 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور….. 65

 

نمودار4-3. مقایسه­ میانگین جذب نوری در طول موج های530 و590 در مقدار جرم  باكتری در هنگام برداشت در بچ های مختلف سویه 134 و 509……………………………………………………………………………………………………………… 66

 

نمودار4-4. مقدار غلظت نهایی باكتری سیاه سرفه (cell109×1) سویه 134 در پایان دوره كشت در هنگام برداشت   66

 

نمودار4-5. مقدار غلظت نهایی باكتری سیاه سرفه (cell109×1) سویه 509 در پایان دوره كشت در هنگام برداشت   67

 

نمودار4-6. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه  سویه 134  توسط  فرمالین و تیومرسال با بهره گرفتن از تست MWG ……………………………………………………………………………………………………………………….. 74

 

نمودار4-7. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی  سیاه سرفه در سویه 509 توسط فرمالین و تیومرسال با بهره گرفتن از تست  MWG……………………………………………………………………………………………………………………….. 74

 

نمودار4-8. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واكسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین نسبت به تیومرسال در سویه 134……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 78

 

نمودار4-9. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واكسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین

 

نسبت به تیومرسال در سویه  509………………………………………………………………………………………………………. 78

 

نمودار4-10. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با سوسپانسیون های سمیت زدایی شده سویه 134 با تیومرسال و فرمالین نسبت به موش های گروه كنترل……………………………………………………………………………………………….. 79

 

نمودار4-11. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده توسط واكسن سیاه سرفه حاصل از سمیت­

 

زدایی با فرمالین وتیومرسال در سمیت زدایی درسوش509 توسط تست MWG ……………………….. 79

 

نمودار4-12. مقایسه نتایج حاصل از توانمندی واكسن های تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV) با واكسن های تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال((TDV …………………………………………………………………………………… 81

 

       فهرست اشكال

 

عنوان                                                                                                                               صفحه

 

شكل1-1. كوكوباسیل سیاه سرفه……………………………………………………………………………………………………………… 7

 

شكل1-2. اتصال بوردتلا پرتوسیس به سلول های پوشش مژه دار مجاری تنفسی……………………………….. 9

 

شكل1-3. شمای شماتیک از پرتوسیس توكسین…………………………………………………………………………………. 11

 

شكل3-1. فرمانتور استفاده شده برای كشت سیاه سرفه……………………………………………………………………… 58

 

خلاصه فارسی

 

سیاه سرفه بیماری عفونی باكتریال دستگاه تنفس است كه عامل آن بوردتلا پرتوسیس از دسته باكتری های گرم منفی می باشد.  در این مطالعه شش بچ از سویه های 134 و 509 باكتری سیاه سرفه تهیه شده و مورد مقایسه قرار گرفتند. از دو روش فیزیكی سانتریفوژ و میكروفیلتراسیون برای جداسازی سلول باكتری از محیط كشت استفاده گردید. سپس سلول­های جداسازی شده باكتری درPBS  خنك و استریل در غلظت متوسط Ou/ml 150-100 حل شده و به دو قسمت تحت نام­های سوسپانسیون سمیت­زدایی با فرمالین (FD) و سوسپانسیون سمیت زدایی با تیومرسال (TD) تقسیم شدند. به سوسپانسیون هایFD  بعد از غیرفعال سازی در حرارت 56 درجه سانتیگراد بمدت 10 دقیقهmM  10فرمالین (7/37 %) اضافه گردید و به سوسپانسیون هایTD  در شرایط مشابه، بعد از غیرفعال سازی با حرارت، w/v 01/0 % تیومرسال بصورت محلول اضافه شد. سپس هر دو سوسپانسیون در دمای 8-4 درجه سانتیگراد برای سمیت زدایی انكوبه شدند. در روزهای 10، 30، 90، 180 و 270 از هر دو نوع سوسپانسیون نمونه برداری شد تا سمیت آنها با انجام تست افزایش وزن موش (MWG) مورد ارزیابی قرار گیرد. در نهایت نیز شش واكسن آزمایشی FD وTD  از مخلوط كردن غلظت های مشابه دو سویه 134 و 509 تهیه گردید تا بتوان توانمندی این واكسن ها را در تست حفاظتی موش با تستKendrick  ارزیابی نمود. نتایج حاكی از آن بود كه روش سمیت زدایی با فرمالین با میانگین دوره  6/26 روز در مقایسه با روش سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین دوره 195 روز، روش كوتاهتری از نظر زمانی برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه است. توانمندی واكسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با فرمالین با میانگین 9/5 از واكسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین 95/5 قدری كاهش را نشان داده است. براساس نتایج حاصل، فرمالین با كاهش دوره سمیت زدایی در درجه حرارت 8-4 درجه سانتیگراد بمیزان 5/7 برابر بسیار مناسب تر از تیومرسال بود. اگرچه توانمندی واكسن حاصل از روش سمیت زدایی با تیومرسال حدود 05/0 واحد بیشتر از واكسن حاصل از سمیت زدایی با فرمالین است ولی تفاوت از نظر آماری ناچیز بود.

 

کلیدواژه ­ها: بوردتلاپرتوسیس- سمیت زدایی- تیومرسال- فرمالین- تست افزایش وزن موش (MWG) – تست حفاظتی موش با تست kendrik

 

فصل اول

 

کلیات

 

1-1. بیان مسأله

 

بیماری سیاه سرفه یک عفونت تنفسی بوده كه توسط باكتری بوردتلا پرتوسیس[1] از دسته باكتری­های گرم منفی ایجاد می شود. نشانه عمده بیماری سرفه هایی است كه ممكن است تا چند هفته نیز طول بكشد كه مشخصه آن پاروكسیزمال[2] شدید با سرفه های ناگهانی است كه اغلب خاتمه آن با یک دم همراه می باشد. بیماری در نوزادان و اطفال بیشتر رخ می دهد (2و18).

 

در تولید واکسن سلولی سیاه سرفه به روش سنتی و جاری آن در مؤسسه واكسن و سرم سازی رازی جدا سازی باكتری به روش ترسیب با اسیدكلریدریک انجام گرفته و سپس به منظور سمیت زدایی[3] توکسین های موجود در سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه از تیومرسال و انکوباسیون درسردخانه به مدت طولانی 12-9 ماه استفاده می گردد. جدا سازی جرم باكتری با بهره گرفتن از اسید از یک سو و فرایند طولانی     سمیت زدایی با مرتیولات از سوی دیگر منجر به کاهش توانمندی واکسن می گردد. لذا در این پروژه با جایگزینی روش های جدا سازی فیزیكی باكتری از محیط كشت بجای روش شیمیایی از یک سو آسیب­های احتمالی به ساختار سلولی باكتری را كاهش داده و از سوی دیگر با بهره گرفتن از فرمالین بجای تیومرسال زمان مورد نیاز برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه به حداقل تقلیل یافت تا ضمن کاهش دوره فرآوری   آنتی ژن بتوان فرآورده ای با کیفیت مناسب تر را تولید نمود (4).